盐胁迫是限制植物生长发育和作物产量的重要非生物胁迫因素(Koyama, 2001)。植物耐盐分子机制的研究成果和生物技术的完善为培育高效耐盐植物提供了良好的契机，但因为起步较晚并且不易深入，故目前有关植物耐盐性基因分子标记方面的研究报道较少。大豆属于中度耐盐植物，盐胁迫条件下产量下降，盐敏感品种则受到的影响更大，开展大豆耐盐性研究尤为必要。大豆的耐盐性属于数量性状，受到数量性状位点(quantitative trait locus, QTL)的控制。在国内外已经有很多关于水稻(Lin, 2004)，小麦(吴玉清, 2007)，玉米(Zacchini, 1997)，番茄(于庆辉, 2010)耐盐性QTL定位的报道。在大豆耐盐性种质资源鉴定和QTL定位方面，张海燕等(张海燕, 2005)利用SSR标记研究了大豆耐盐性种质资源遗传多样性并进行标记辅助鉴定；Lee等(Lee, 2004)在大豆连锁群上检测到一个苗期耐盐的主效QTL，在大田试验和温室鉴定中可解释41%和60%的遗传变异；郭蓓等(郭蓓, 2000)以大豆耐盐品种和盐敏感品种组合的F₂群体为实验材料，利用改良的BSA法，筛选和鉴定与大豆耐盐性基因紧密连锁的PCR标记，通过对耐(敏) 盐品种池和一个组合F₂的耐(敏)盐池进行鉴定，获得一个与大豆苗期耐盐基因座位紧密连锁的共显性标记。有关大豆芽期耐旱性(李灿东, 2011)和耐低温(蒋洪蔚, 2009)的QTL定位已有报道，对大豆芽期耐盐性QTL定位研究较少。

本研究利用回交导入系群体进行大豆芽期耐盐性鉴定，获得稳定可靠的定向选择群体，分析其基因型结构，利用两种方法定位耐盐QTL位点，为培育芽期耐盐性大豆提供可靠的标记信息。

1结果分析
1.1等位基因导入频率分析
以BC₂理论值(0.125)为预期值进行卡方检测。由于耐盐、耐低温定向选择作用，较之随机群体，选择群体的供体等位基因导入频率具有较大的偏离(表1)。

 

表1 耐盐导入系的供体等位基因频率及其偏离 Table 1 Frequency and deviation of donor alleles in introgression lines for salt tolerance

1.2耐盐QTL定位
1.2.1耐盐导入系卡方检测
根据供体等位基因导入频率在耐盐选择群体和随机群体中的总体表现，利用卡方测验作近似检测，设置检测的域值为P<0.05。13个区域的导入频率呈现显著变化(表2; 图1)。其中包括A1、A2、B1、B2、C2、D1a、F、H、J、L和O连锁群上的Sat_271、Satt442、Sat_331、 Satt726、Satt556、Satt577、Satt640、Satt184、Satt522、Sat_180、Satt529、Satt513和 Sat_108。这些位点的供体片段导入频率都明显大于随机群体中的供体片段导入频率。由于受定向选择的影响，所检测到的大多数位点均表现为供体亲本的超导入，可以认为这些位点与耐盐性选择密切相关。

 

表2 耐盐性相关位点的卡方检测 Table 2 Distribution of salt tolerance loci by chi-square test

图1 大豆芽期耐盐QTL位点在连锁群上的分布 Figure 1 Distribution of QTLs related with salt tolerance in germination stage

1.2.2耐盐导入系方差分析
通过对盐胁迫条件下各导入系发芽率和基因型的方差分析，在0.05的显著水平下共检测到8个位点，都表现为供体片段的正效应，分布于C1、D1b、E、I、 N和O 6个连锁群上(表3; 图1)。其中O连锁群的Sat_108位点的贡献率达到25.59%，并且与卡方检测的位点一致，表现为供体片段的超导入，另外7个位点的供体片段导入频率未发生明显变化，因此卡方检测不显著。对盐胁迫条件下各株系发芽率和基因型进行加性效应分析，Sat_108、Satt231、Satt271、 Satt255和Satt411加性效应值分别为0.10、0.10、0.05、0.03和0.05，这5个位点增强盐胁迫条件下发芽率即增强耐盐性的有利等位基因来自供体亲本Harosoy，其余3个(Sat_170, Satt180和SOYGPATR)有利等位基因来自于红丰11。通过方差分析，影响盐胁迫条件下发芽势的5个位点被定为在E、N和O连锁群上，有4个(Satt231, Satt549, Satt255和Sat_108)增强耐盐性的有利等位基因来自于供体亲本Harosoy，Satt411有利等位基因来自于红丰11，Sat_108位点贡献率达到39.42%，且与卡方检测的位点一致。影响盐胁迫条件下发芽指数的5个位点被定位在C1、E、N和O连锁群上，其中有3个(Satt231, Satt255和Sat_108)增强发芽指数的有利等位基因来自于供体亲本Harosoy，其余2个位点有利等位基因来自于受体亲本。通过对芽期3个指标的隶属函数值之和与基因型的方差分析定位到5个位点，除Satt411和SOYGPATR之外其它3个位点耐盐有利等位基因来自于供体亲本 Harosoy，其中O连锁群的Sat_108位点的贡献率达到38.54%，并且与卡方检测的位点一致，表现为供体片段的超导入，此位点也是4个耐盐指标经方差分析共同定位到的位点。

 

表3 耐盐性位点的方差分析 Table 3 Distribution of salt tolerance by ANOVA analysis

2讨论
2.1大豆芽期耐盐性鉴定
前人对大豆耐盐性研究以大豆耐盐种质资源的鉴定为基础，已有关于大豆苗期耐盐性QTL定位的报道(郭蓓, 2000)。郭蓓对获得的苗期耐盐标记在F₂群体和多个耐、感品种间进行了验证，田间耐盐性鉴定结果与分子标记鉴定结果相符程度为91.5%，表明通过分子标记辅助选择获得的耐盐标记是可靠的，大豆耐盐性室内鉴定成为可能(郭蓓, 2000)。本研究利用大豆高代回交导入系材料，首先确定亲本芽期耐盐程度，结合分子标记对群体进行芽期耐盐性筛选鉴定。大豆芽期对盐胁迫的忍耐程度反映的是在胁迫条件下种子吸水膨胀发芽的综合能力，参考前人鉴定方法结合本实验室鉴定体系，以能够反映种子活力的发芽率、发芽势和发芽指数作为评价大豆芽期耐盐性的3个基本指标，并结合隶属函数做综合评价。耐盐隶属函数法定位到的位点与其它3个指标分别定位到的位点相比也有很好的重复性，说明本试验中的盐胁迫筛选条件是有效的，保证了耐盐筛选出了盐胁迫下表现优于亲本红丰11和Harosoy的株系。虽然芽期耐盐的大豆品种全生育期不一定都表现为耐盐(邵桂花, 1986)，而且对于生产实际来说，苗期的耐盐性更重要，但是本实验利用导入系材料结合分子标记利用两种定位方法获得耐盐位点的思路是可行的，利用获得的耐盐位点可以进行大豆芽期耐盐性验证，耐盐导入系材料可以继续进行遗传重叠研究和抗逆聚合育种。

2.2 QTL定位的可靠性分析
利用红丰11和Harosoy构建的回交导入系群体为筛选材料，导入系之间的差异在于携带不同染色体片段，它们遗传背景的一致性提高了定位的可靠程度。在严格鉴定获得可靠的超亲耐盐导入系材料基础上，将3个芽期鉴定指标以及隶属函数这4个表型鉴定获得的表型值结合基因型数据经过方差分析共定位到10个耐盐位点，4个指标定位结果之间有很好的一致性。利用选择群体以方差分析的方法定位QTL同时，随机群体的使用也是很有必要的。由于定向选择的作用导致群体等位基因频率发生变化，借助基于遗传搭车理论的卡方检测可以定位相关位点。但是由于导入系群体特性等原因，导入系群体中的一些位点未经选择也会表现相对于理论值的严重偏分离(蒋洪蔚, 2009)，通过选择群体与随机对照群体供体片段导入频率之间卡方检测才是定位QTL的依据。相对于导入频率的理论值来说，利用随机群体供体片段导入频率更可靠。卡方分析检测到13个偏分离位点，O连锁群的Sat_108是在四个芽期指标和卡方分析都检测到的位点，可能与大豆芽期耐盐性有密切联系。

理论上说，携带不同染色体片段导致导入系间、导入系与轮回亲本间的差异，导入系与轮回亲本以及导入系之间表型上的差异都可以认为是由于导入片段的差异引起的(郑天清, 2009)。对导入系亲本的耐盐鉴定发现红丰11是耐盐品种，Harosoy属于中间型品种，对芽期耐盐超亲导入系的耐盐位点加性效应分析表明，红丰11 某些等位基因对超亲个体耐盐有作用，但超亲个体的耐盐和耐低温位点主要是由供体亲本导入片段提供的，例如以发芽率为指标方差分析定位到的8个耐盐位点中，有5个位点增强耐盐性的有利等位基因来自供体亲本Harosoy，也可能是这供体导入片段与受体某些片段互作导致了后代产生了芽期耐盐性。所以这5个位点可能对提高后代耐盐性起到了重要作用。这种现象在种质资源中比较普遍，培育导入系结合分子标记进行鉴定是挖掘这类“隐蔽”有利基因的有效途径。两种定位方法同时定位到的位点偏少，可能存在的原因是：一些方差分析检测到的位点，无法利用简单的表型选择通过改变群体的基因频率来加以改良(Zhang, 2006)如Satt180和Satt411完全没有检测到显著的等位基因频率偏离，因此，这些位点在卡方检测中不会被检测到。即便如此，本研究所检测到的芽期耐盐位点仍然是可靠的。

3材料与方法
3.1试验材料
供体亲本Harosoy来自美国的外源品种，受体(轮回亲本)红丰11为黑龙江省主栽品种，以红丰11为母本与供体杂交获得杂种F₁，F₁再与轮回亲本回交获得BC₁F₁，本试验材料是BC₂F₃世代经过芽期耐旱筛选得到的BC₂F₄世代材料，共46个株系。从与抗性导入系同一世代材料中随机选取50粒种子组成随机对照群体。试验的群体构建于2004~2008年。

3.2芽期耐盐性鉴定
亲本芽期耐盐程度鉴定选择了代表芽期抗(绥农14, 合丰41)、中(黑农37, 合丰25)和敏(中豆27, 中黄22)的六个品种(那桂秋, 2009)结合亲本(红丰11, Harosoy)进行芽期耐盐性鉴定，以大豆芽期发芽率、发芽势和发芽指数三个指标确定红丰11是耐盐品种，Harosoy属于中间型品种。

根据前期预备试验的结果，并参照程海涛等(2008)和郭房庆和汤章城等(1999)的方法，确定红丰11的致死临界NaCl浓度为1.75% (W/V)。各株系种子用1%的次氯酸钠溶液消毒后，每20粒置于一个灭菌的9 cm培养皿中，上下各铺一层灭菌滤纸，放入20℃培养箱吸胀12 h后取出倒掉剩余水分，加入25 mL浓度为1.75% (W/V)的NaCl溶液，红丰11作为对照，以芽长达到种子种脐一半为发芽标准，计算每个株系的发芽率、发芽势和发芽指数，具有显著差异的株系视为超亲株系。

3.3性状调查
耐盐和耐低温胁迫处理 8 d，每隔1天调查各株系种子发芽粒数，根据调查结果计算各株系发芽势(germination energy, GE)、发芽率(germination rate, GR)和发芽指数(germination index, GI) (程海涛等, 2008)。大豆芽期综合评价应用模糊数学中的隶属函数值法(祁旭升, 2010)，以发芽势、发芽率和发芽指数为指标对每个株系隶属函数值(MF)进行计算。计算公式如下：


3.4等位基因导入频率分析
利用上述72个SSR标记分别对耐盐选择群体、耐低温选择群体及BC₂随机群体的供体等位基因导入频率进行分析。计算各标记供体等位基因导入频率，公式如下(与轮回亲本一致基因型记A, 与供体亲本一致基因型记B, 杂合基因型记H, 缺失或模糊记C)：


3.5基因型分析及QTL检测
从黑龙江省农垦科研育种中心生物实验室合成的1 000对大豆SSR引物中筛选出双亲之间存在多态性的SSR引物346对，以连锁群为单位从中选出在20个连锁群中分布均匀且具有群体多态性的SSR引物 72对，对BC2F4世代芽期耐盐选择群体进行SSR分析。另外，从BC₂世代中随机选取50粒种子组成随机对照群体，用上述72对SSR引物进行标记分析，获得了46个有效基因型数据。利用获得的基因型数据对供体等位基因导入频率与随机群体的偏离情况进行差异显著性检测，以卡方测验作近似的显著性检测，显著水平为0.05。

利用芽期耐盐鉴定获得的超亲个体的基因型数据，结合芽期耐盐相关性状调查数据，采用SAS 8.2 (Statistics Analysis System)软件中的单向方差分析(ANOVA)检测QTL及其贡献率，以P<0.05显著水平作为取舍主效QTL的临界值，贡献率的计算公式是，(a_i: 单位向量; λ_i: 原指标相关系数矩阵相应的特征值)。当1个QTL与2个或2个以上标记连锁时，以F值最高的标记作为与QTL连锁的标记列出(Xu, 2005)。加性效应值的计算参考了Zang等(2008)在水稻遗传重叠研究中加性效应的计算方法以及结合本研究加性效应是指红丰11等位基因被供体 Harosoy等位基因替代后的效应。加性效应通过含有供体基因型全部株系表型平均值与轮回亲本平均值的差值估算，差值的二分之一为这单个基因拷贝的加性效应。

作者贡献
邱鹏程、张闻博是本研究的实验设计执行人并完成数据分析，论文初稿的写作；范冬梅、曾庆力参与实验研究；刘春燕、蒋洪蔚及李灿东参与实验设计；陈庆山、胡国华是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改，是本文的责任作者(通信作者)。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由转基因专项(2009ZX08009-013B)、国家“948”项目(2006-G1A)共同资助。

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